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    PCR實驗室汙染與防控

        在眾多的生物實驗室中,分子生物學檢測方法如PCR因其檢測靈敏度高、準確度好、操作方便、快速等優勢已經被廣泛應用。不過正是由於它的高靈敏性,實驗室中極微量的汙染源都有可能導致檢測結果的假陽性,所以對環境中汙染源的防控也極為重要。一旦出現實驗室環境汙染,比如樣本之間交叉汙染、試劑汙染、儀器汙染、陽性對照汙染、PCR擴增產物汙染、氣溶膠汙染等,其中氣溶膠汙染是一個非常重要而被忽視的汙染源。實驗室出現氣溶膠汙染,需要較長的時間進行根除。

    一、汙染原因

        1、樣本之間交叉汙染。

        標本汙染主要有收集標本的容器被汙染;標本存放運輸時,由於密封不嚴或容器外粘有標本而造成相互間交叉汙染;核酸模板在提取過程中,由於加樣槍汙染導致標本間汙染;手動提取核酸樣本時,汙染的手套觸摸離心管內蓋導致的汙染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的汙染。

        2、PCR試劑汙染

        PCR試劑在配製過程中,移液槍、槍頭、離心管等原因造成試劑被PCR核酸模板汙染。

        3、不同工作區域移液槍等耗材交叉使用。

        將易汙染區域的移液槍、槍頭、離心管等耗材拿到潔淨區使用引起的汙染;

        4、離心機轉子未定期擦拭。

        離心機通常進行各種試劑組分、不同盲樣的離心,如果離心管外部沾染病毒、陽性核酸或陽性質粒,容易造成汙染。

        5陽性對照造成的汙染。

        開蓋時間過長高濃度質粒揮發到室內,陽性對照組分未使用完任意丟棄,加完陽性對照的槍頭未放入消毒液中。

        6擴增產物開蓋造成的汙染。

        這是PCR試驗中最主要、最常見的汙染原因。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高於PCR檢測拷貝的極限,PCR產物開蓋後,極易迅速造成擴散,極微量的PCR產物汙染,就可形成假陽性。

        7各個實驗室擦桌布、掃把,簸箕,工作服交叉使用。

    二、PCR汙染的監測

        一個正規的實驗室,要時刻注意監測實驗室的汙染情況。了解實驗室有無汙染,汙染原因,汙染程度,以便采取有效措施,防止和消除汙染。一般通過陰陽性對照檢測汙染情況。

        1、陰性對照:

        不將模板DNA或RNA加入到PCR試劑中,進行PCR擴增,對試劑是否汙染進行監測。陰性水樣參與核酸提取和擴增監測整個試驗流程是否正規。

        2、陽性對照:

        PCR陽性對照對於被建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都是必需設有的, PCR反應是否成功,PCR陽性對照是一個重要的參考標誌。

        如果陰性對照和陽性對照均成立,說明質量控製成立,實驗室未被汙染,樣本檢測結果才有效。

        如果陰性對照不成立,出現擴增曲線,說明陰性對照被核酸汙染,需要追溯汙染源。

    試劑汙染

    重新更換新拆封的合格試劑檢測,

    如果陰性對照仍然有擴增曲線,初步判定為實驗室汙染。

        實驗室汙染

    監控對象:實驗室內的儀器設備、空氣、物體表麵

    監測方法:1.1水樣驗證:每個實驗區放置10ml單蒸水水(敞口),1個小時後,取樣200ul。

    1.2物體表麵擦拭取樣:用棉拭子蘸取生理鹽水,在實驗室台麵(尤其是四周死角)、儀器表麵和內孔塗抹取樣後放入約0.5mL生理鹽水中取樣。


    三、解決PCR實驗室汙染的方法


        (1)開窗通風:如在短時間內要消除實驗室汙染,開窗通風促進實驗室內空氣流通,使停留在室內的核酸排放到室外。

        (2)紫外燈照射:將實驗室內生物安全櫃內物品平鋪,打開離心機內蓋,然後將紫外等打開照射12-24小時,通風12小時以上

        (3)消毒液降解核酸:及時用1%-2%的次氯酸鈉擦拭操作台麵和儀器,用10%次氯酸鈉浸泡試驗器具,同時用10%次氯酸鈉洗拖布擦拭地麵。

        (4)高壓:試驗耗材、工作衣進行121℃30分鍾高壓

        (5)使用商品化核酸去除劑噴灑室內降解核酸。

        (6)陽性汙染特別嚴重,可以采取高錳酸鉀甲醛(2:1)過夜熏蒸實驗室。

    四、PCR實驗室如何預防汙染

        1、合理的實驗室分區


        2、實驗操作流程:

        (1)樣品製備區進行樣品處理,核酸提取;

        (2)配液區配置反應體係:酶混合液和PCR反應液混合,分裝至PCR反應管

        (3)樣品製備區加樣:樣核酸和陰陽性對照加至反應液中;

        (4)PCR擴增區上機擴增檢測。務必保持單向操作流程,避免各區實驗室汙染

        3、各個實驗區內試驗用品專區專用

        配液區是最潔淨的試驗區域樣品製備區的潔淨度稍差, PCR擴增區是最易被汙染的區域,各區之間試驗物品專區專用,避免因交叉使用造成實驗室汙染。

                 4、試驗操作要規範

        (1)正確使用移液槍,保證試劑配比計量正確,同時避免液體吸入移液槍口造成汙染

        (2)實驗的過程中應勤換手套,在進出不同區域或進行模板操作後,都應及時更換手套。

        (3)試劑盒各組分在打開之前應先做瞬時離心(約10s),將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,從而減少汙染手套或加樣器的機會。開管動作要輕,以防管內液體濺出或形成氣溶膠,造成汙染。

        (4)樣本量較多時,應將反應液預混,再分裝至PCR反應管,最後添加核酸模板,以減少單個添加操作繁瑣造成的汙染。

        (5)每次試驗必須設定陰性對照和陽性對照,讀取結果時,在保證陰陽性對照均成立的情況下,判讀樣本結果才有效。

        (6)實驗結束後PCR反應管嚴禁打開,及時放置次氯酸鈉消毒液中浸泡。

        5、做好日常消毒工作

        每日工作完成後,及時處理實驗室內廢棄物,消毒液擦拭操作台麵和儀器,拖布蘸取消毒液擦拭地麵,開窗同風10分鍾以上。

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